CRISPR/Cas9 per riparà u genu DEB (2025)

Stu prughjettu di un annu hà furnitu evidenza preliminare per l'usu di un metudu di terapia genica CRISPR / Cas9 chjamata riparazione diretta di l'omologia (HDR) per trattà l'EB. I circadori anu utilizatu HDR in cellule pigliate da biopsie di a pelle da cinque persone cun EB distròfica. U so prucessu hà purtatu e molécule di editazione di geni in e cellule in u laboratoriu utilizendu un impulsu di elettricità (elettroporazione) invece di virus mudificati (vettori virali). Anu scupertu chì puderanu correggere i cambiamenti genetichi in modu efficace in dui casi, à un certu puntu in unu, è in l'altri dui ùn era micca efficace. Stu travagliu hà dimustratu chì l'HDR puderia esse adupratu in a terapia genica EB, ma avissi da esse ottimizzatu per ogni paziente individualmente.

U prugressu di u prugettu hè statu prisentatu à u Cungressu Collaborativu ESGCT / SITGEC (Roma, Italia) 22-25 ottobre 2024. Poster numeru P1008. Vede u poster.

A mità di u prugettu, i circadori informanu chì anu righjuntu cù successu a mità di e so tappe. I so "patchs" genetichi funzionanu in modu più efficiente di ciò chì era previstu, ma sò più chjuchi. Questu significa chì anu bisognu di più di elli è fucalizza nantu à questu per a seconda mità di u prugettu.

Ricercatore principale: U duttore Sergio López-Manzaneda hè un ricercatore à u CIEMAT cù una forte sfondate in l'edizione di genoma.

Co-ricercatori: U Dr Fernando Larcher hè prufessore assuciatu di biochimica à l'Università Carlos III di Madrid è Capu di Divisione in CIEMAT (Divisione di Biomedicina Epiteliale).

Alex Bassons Bascuñana hè un studiente di PhD in u Gruppu di Biomedicina Epiteliale di l'Unità di Innovazione Biomedica di u CIEMAT.

Collaborazione: U Dr Paula Rio hè un espertu ricunnisciutu internaziunale in l'editing di geni è a terapia genica di e malatie ematopoietiche ereditarie, da a scienza basica à i prucessi clinichi.

"Questu approcciu di editazione di geni non virali cerca una strategia à pocu costu è universale per generà una biblioteca di arnesi capaci di affruntà ogni mutazione cunnisciuta ... In futuri studii preclinici, i keratinociti è i fibroblasti editati di geni "patchati" da i pazienti seranu usati. per generà equivalenti di pelle bioingegneria ".

– Dr Sergio López-Manzaneda

Titulu di cuncessione: Patching di edizione di genoma non virale di COL7A1.

In questu prughjettu, prupunemu una strategia di editazione di u genoma cuncintrata in u trattamentu micca solu di una mutazione puntuale, ma di gruppi di mutazioni vicini chì causanu RDEB, riparà esoni pieni chì li ospitanu. Stu "patching geneticu" hè basatu annantu à u mecanismu naturali di riparazione di DNA di Recombinazione Omologa (HR) facilitatu da u sistema CRISPR / Cas9. I "patchs" rapprisentanu picculi (300-400 coppie di basi) mudelli di DNA di donatori HDR a doppia fila chì seranu cuncepiti da sequenze di geni abbastanza per copre pochi esoni contigui, in questu casu, currispondenu à u gene COL7A1 chì codifica u collagene VII. U nostru scopu hè di carattarizà (efficacità, sicurezza) è di standardizà l'usu di sti tecnulugia cù l'idea di avè patch specifichi prontamente dispunibili per affruntà gruppi individuali di mutazioni. A tecnulugia non virale pruposta per u trattamentu di e cellule di u paziente RDEB ex vivo faciliterà a so traduzzione à a clinica à pocu costu.

Unu di l'approcci terapeutichi più promettenti per l'EB hè l'edizione di u genoma utilizendu e tecnulugia CRISPR / Cas9. Duranti l'ultimi anni 7, u nostru laboratoriu hà travagliatu attivamente in questu campu furnisce dati forti di prova di cuncettu chì miranu à traduce i so risultati à a clinica. Mentre simu in u puntu di l'applicazione clinica cù unu di questi approcci chì hà ottenutu una designazione di Drug Orphan da l'Agenzia Europea di i Medicamenti (EU/3/20/2253), cuntinuemu a ricerca di strategie di edizione di genoma più efficaci, più sicure è clinicamente rilevanti.

In questu prughjettu, prupunemu di pruvà un approcciu innovativu di edizione di geni chì ùn hà micca bisognu di l'usu di vettori virali (tuttu u materiale hè introduttu da una sola elettroporazione). L'obiettivu hè di utilizà sti "patch genetichi" per correggerà e regioni mutate dopu avè tagliatu sta regione genetica cù a tecnulugia CRISPR / Cas9. Avemu cuncepitu quattru "patch" differenti, questu significa, mudelli di donatori dsDNA specificamente modificati in i so fini da una tecnulugia proprietaria di u nostru fornitore (Tecnulugie di DNA integrate, IDT) per favurizà HDR. Questi mudelli cuntenenu dui esoni è u so circondu (73 è 80, duie "patch" ognunu) è quattru punti di cut differenti (dui per l'esone 73 è dui per l'esone 80). Questi mudelli (circa 300-400 bp) coprenu ancu l'exoni vicini.

Avemu u scopu di valutà l'estensione di a riparazione in i "patchs" chì ci permettenu di indirizzà gruppi di mutazioni o, se u sistema funziona abbastanza bè, per correggerà cumplettamente l'exoni in i "patches". Cridemu chì stu rumanzu, senza virali, strategia di edizione genica persunalizata puderia esse facilmente traduttu à a clinica cù un costu economicu bassu significativu.

Avemu righjuntu cù successu a mità di e tappe di cuncessione. Inizialmente, a nostra strategia hà u scopu di riscrive u genoma utilizendu "patchs" di DNA per copre coppie di esoni (specificamente di mira mutazioni in coppie di esoni: 72-73, 73-74, 79-80 è 80-81). Tuttavia, i patch d'ADN chì avemu usatu s'hè rivelatu un pocu sfarente da ciò chì ci aspettavamu. Queste patches ponu riscrive u genoma cù più di 80% di efficienza, chì hè più altu di l'informati prima, ma a so azzione hè limitata à una finestra stretta. Dopu questu, a nostra strategia di a fase 2 si concentrerà avà nantu à i patch di DNA individuali per ogni esone. Per assicurà chì ùn mudificàmu micca e sequenze di DNA sani, u "tagliu moleculare" CRISPR / Cas9 hà da mira solu sequenze mutate. Questu averebbe bisognu di picculi RNA specifichi per ogni mutazione, mentre chì un patch di DNA cumuni pò esse usatu per ogni esone. (Da u rapportu di lugliu 2024).

Inizialmente, a nostra strategia hà u scopu di riscriva u genoma utilizendu "patch" di DNA per copre coppie di esoni, specificamente per mutazioni in coppie di esoni 72-73, 73-74, 79-80 è 80-81. Tuttavia, i patch di DNA utilizati differivanu ligeramente da e nostre aspettative. A cuntrariu di e strategie HDR classiche, stu novu sistema IDT (Tecnulugie di DNA Integrate) ùn pò micca riscrive e sequenze oltre 30 nucleotidi, limitendu a so azzione à una finestra stretta.

Dopu questu, a nostra strategia di fase 2 hè stata cuncentrata in patch di DNA individuale per ogni esone. Per assicurà chì e sequenze di DNA sani ùn sò micca modificate, u "tagliu moleculare" CRISPR / Cas9 mira solu sequenze mutate. Questu hà bisognu di picculi RNA specifichi per ogni mutazione, mentre chì un patch di DNA cumuni puderia esse usatu per ogni esone. Avemu riescrittu bè l'ADN à una alta efficienza (> 70%) in 2 di 5 mutazioni (paziente 2 è paziente 73.4), ottenutu efficienza moderata (> 25%) in altri 2 (paziente 73.2 è paziente 2), è appena mudificatu (5%) (E73.3). Ancu se a classificazione di i cloni curretti hè una strategia fattibile, l'usu di sti cloni per u trasplante presentava una sfida tecnica in i prucessi clinichi se partendu da tassi di efficacità bassa. Tuttavia, stu travagliu furnisce almenu duie alternative terapeutiche promettenti per e mutazioni c.6041_6042delAG è c.6100G> A, utilizendu un approcciu HDR non virali invece di u sistema tradiziunale di spedizione di vettore virali. (Da u rapportu finali di marzu 2025.)